qPCR 内参基因怎么选？18S 还是 GAPDH？
做 qPCR 第一件事不是设计引物,是选内参。内参选错,96 个孔全白费。结论先行:没有"万能内参",只有"适合你实验体系的内参"——18S 和 GAPDH 是新手最爱,但都各有坑,选之前先过三原则,再花 2 天在自己体系里验证。
一、内参三原则(选之前先背)
| 原则 | 含义 |
|---|---|
| 组织间稳定 | 在你比较的所有组织/样本里表达量恒定 |
| 处理不波动 | 实验处理(药物/缺氧/转染)不影响它 |
| 跨样本一致 | 不同批次、不同代次表达稳定 |
二、18S 的坑
- 丰度极高,Ct 值常在 10–12,与目的基因(Ct 20–30)差太多,线性范围对不上,稀释操作易引入误差
- 是 rRNA 不是 mRNA,反转录用 oligo(dT) 时它根本不逆转录,定量意义打折
- 适合:模板量极少、目的基因也高表达的体系
三、GAPDH 的坑
- 最常用但最"娇气":细胞增殖状态、缺氧、糖代谢通路激活都会让它波动
- 肿瘤细胞缺氧处理时,GAPDH 常跟着处理组一起变,内参变"参战"
- 适合:常规细胞系、无代谢类处理、组织样本(需先验证)
四、正确做法(两步)
- 先跑 2–3 个候选内参(GAPDH/ACTB/B2M 或 18S),在你自己的处理条件下测 Ct
- 算每个内参的 Ct 标准差,选波动最小的那个;可用 geNorm(M 值 < 0.5 稳定)、NormFinder、RefFinder 等算法评估
五、检测方法一致性
内参和目的基因必须都用 SYBR 或都用探针法,混用扩增效率不同,ΔΔCt 直接算错。另外 ΔΔCt 法有三个前提:目的基因与内参效率差 < 10%、内参已验证稳定、扩增单一(熔解曲线单峰+凝胶单条带)。
常见问题 FAQ
Q: 内参 Ct 波动多少算稳? 样本间波动 < 3 个循环可接受;处理组与对照组间差异大就要换内参。
Q: 换了组织/处理条件要重新验证吗? 要。内参稳定性随组织、处理、物种不同而变,没有一次验证吃到底。
Q: 可以用两个内参吗? 可以,geNorm 推荐 2 个内参几何均值归一化,比单内参更稳。
依据:MIQE 指南(Bustin et al., Clin Chem 2009)、geNorm(Vandesompele et al., Genome Biol 2002)、Sigma/Thermo/IDT 官方文档。
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